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冷冻保藏是指将菌种于-20 ℃以下的温度保藏， 冷冻保藏为微生物菌种保藏十分有效的办法。经过冷冻，使微生物代谢活动中止。一般而言，冷冻温度愈低，作用愈好。为了保藏的成果愈加令人满意，通常在培育物中加入一定的冷冻保护剂;一起还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺陷是培育物运输较困难。

*先要给大家说的就是液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的*好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196 ℃)或其蒸汽相中(-l56 ℃)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5～1 mL入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以(1-2) ℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30 ℃)。待细胞冻结后，将致冷速度降为1 ℃/min，直到温度达到-50 ℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196 ℃)或气相(-156 ℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70 ℃冰箱中冷冻4 h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，*常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，*终使用浓度一般为甘油10 %、二甲亚砜5 %。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜*好为过滤灭菌。

普通冷冻保藏技术(-20 ℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5～20 ℃的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1～2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。

超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60 ℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20 %甘油或10 %二甲

亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70 ℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在(1～2) ℃/min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

真空冻干保藏：真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到*大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需(7～10) d，培养细菌约需(24～28) h，培养酵母约需3 d。然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为(109～1019)个/mL，取(0.1～0.2) mL菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1 %～5 %，使培养物干燥。*后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的*为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。